L'opera prese forma verso la fine del XIX secolo, per merito dei fratelli Onofrio e Antonio Petruzzelli, commercianti di origine triestina, che convinsero il Comune a cedergli il terreno, con l'impegno a realizzare e gestire un nuovo teatro.
Disegnato dall'ingegnere barese Angelo Messeni, l'edificio venne modellato, architettonicamente, sui migliori esempi di teatro europeo, in particolare il San Carlo di Napoli e l'Opéra di Parigi, riflettendo il gusto umbertino, diffuso all'epoca e in linea con le altre costruzioni del Borgo Murattiano.
Posta la prima pietra nel 1897, i lavori vennero portati a termine nel 1903, con un costo complessivo di 1.600.000 lire (cifra esorbitante per quegli anni). Ad inaugurare il Teatro Petruzzelli, il 14 febbraio di quell'anno (121 anni fa), fu l'opera lirica Gli Ugonotti di Giacomo Meyerbeer.
Dal 1967 il teatro è gestito dalla Fondazione lirico sinfonica Petruzzelli e Teatri di Bari i quali attuali soci sono: Ministero dei beni e delle attività culturali, Comune di Bari, Città metropolitana di Bari, Regione Puglia e l'impresa edile Cobar Spa.
Dopo aver ospitato illustri compositori, come Pietro Mascagni, e cantanti, su tutti Frank Sinatra e Luciano Pavarotti, nella notte tra il 26 e il 27 ottobre 1991 venne in parte distrutto da uno spaventoso incendio di origine dolosa. Ricostruito fedelmente al progetto originario, il nuovo teatro venne riaperto alla fine del 2009.
